Το παιχνίδι ξεκινά με τον Chell να ξυπνά σε ένα μικρό γυάλινο δωμάτιο που έχει μόνο ένα κρεβάτι, μια τουαλέτα και ένα ραδιόφωνο μέσα. Της λέει ο GLaDOS ότι οι δοκιμές θα ξεκινήσουν σύντομα, και μια πορτοκαλί πύλη ανοίγει σε έναν από τους τοίχους. Μόλις ο παίκτης περάσει, μπαίνει στα δωμάτια δοκιμών και αρχίζει τις δοκιμές. Υπάρχουν συνολικά 20 αίθουσες δοκιμών, που ονομάζονται Test Chambers.
Τα τεστ ξεκινούν απλά. Ο Chell πρέπει να μαζέψει κουτιά, που ονομάζονται Κύβοι Αποθήκευσης με Βάρος (εν συντομία Κύβοι), και να τα τοποθετήσει σε κουμπιά, τα οποία θα ανοίξουν την πόρτα για την έξοδο του θαλάμου. Σε αυτό το σημείο, ο GLaDOS μιλάει στην Chell ως οδηγός, την επαινεί και της υπόσχεται κέικ όταν τελειώσουν οι δοκιμασίες. Κοντά στην αρχή του παιχνιδιού, η Chell παίρνει τη φορητή συσκευή Aperture Science Handheld Portal Device, γνωστή και ως Portal Gun. Στην αρχή, το Portal Gun της δημιουργεί μόνο μπλε πύλες και οι πορτοκαλί πύλες δημιουργούνται από τον GLaDOS. Αργότερα, η Chell παίρνει το πλήρες Portal Gun και μπορεί να φτιάχνει τόσο μπλε όσο και πορτοκαλί πύλες.
Οι δοκιμασίες γίνονται όλο και πιο επικίνδυνες όσο προχωράτε στο παιχνίδι. Σε ορισμένα δωμάτια, υπάρχει δηλητήριο στο πάτωμα. Σε άλλα, υπάρχουν μπάλες ηλεκτρισμού που ονομάζονται High Energy Pellets και θα σκοτώσουν την Chell αν τις αγγίξει. Κατά τη διάρκεια αυτών των δοκιμασιών, ο GLaDOS γίνεται όλο και πιο σαρκαστικός, δίνοντας στην Chell άχρηστες συμβουλές, όπως "Το πάτωμα εδώ θα σε σκοτώσει. Προσπάθησε να το αποφύγεις". Κάποια στιγμή, ο GLaDOS λέει στην Chell ότι ένας θάλαμος είναι χαλασμένος και ότι πρέπει να περάσει μέσα από έναν θάλαμο γεμάτο από όπλα φρουράς, που ονομάζονται Turrets. Αν ένας πυργίσκος δει την Chell, θα την πυροβολήσει μέχρι να πεθάνει. Σε αυτόν τον θάλαμο υπάρχει ένα κρυφό δωμάτιο. Στο κρυφό δωμάτιο υπάρχουν σχέδια και γραπτά στους τοίχους που άφησε ένα άγνωστο άτομο. Τα γραπτά λένε πράγματα όπως "το κέικ είναι ένα ψέμα" και "πάντα παρακολουθεί" με την εικόνα μιας κάμερας. Υπάρχουν κι άλλα τέτοια δωμάτια σε μεταγενέστερους θαλάμους.
Σε έναν άλλο θάλαμο, ο Chell πρέπει να χρησιμοποιήσει τον κύβο Weighted Companion Cube, ο οποίος μοιάζει με κύβο αποθήκευσης με καρδιές πάνω του, για να λύσει το τεστ. Κατά τη διάρκεια του τεστ, η GLaDOS λέει στην Chell αρκετές φορές ότι ο Companion Cube δεν είναι ζωντανός, αλλά στο τέλος του τεστ, λέει στην Chell ότι πρέπει να "σκοτώσει" τον Companion Cube για να περάσει στο επόμενο τεστ.
Κατά τη διάρκεια της τελευταίας δοκιμής, ο Chell πρέπει να σταθεί σε μια κινούμενη πλατφόρμα. Στο τέλος της διαδρομής της πλατφόρμας, αυτή θα τη μεταφέρει σε ένα λάκκο με φωτιά. Ο GLaDOS ευχαριστεί την Chell για την πραγματοποίηση των δοκιμών. Την τελευταία στιγμή, η Chell χρησιμοποιεί το Portal Gun για να ξεφύγει από την παγίδα. Ενώ προσπαθεί να ξεφύγει από το κτίριο, η Chell οδηγείται σε ένα δωμάτιο όπου βρίσκει τον GLaDOS. Η Chell σπάει μια λευκή μπάλα που έπεσε από τον GLaDOS. Η GLaDOS της λέει ότι ήταν ανόητη που την έσπασε επειδή δεν ήξεραν τι ήταν, αλλά η GLaDOS γρήγορα καταλαβαίνει ότι ήταν ο πυρήνας ηθικής της. Λέει στην Chell ότι οι άνθρωποι που δούλευαν για την Aperture Science τον εγκατέστησαν για να την κάνουν να σταματήσει να τους σκοτώνει με τη "Θανατηφόρα Νευροτοξίνη". Επειδή η Chell τον έσπασε, η GLaDOS μπορεί να χρησιμοποιήσει ξανά τη Νευρο-Τοξίνη. Ο Chell έχει χρονικό όριο 6 λεπτών για να σκοτώσει τη GLaDOS πριν η Νευρο-Τοξίνη σκοτώσει τον Chell. Αφού σπάσει κομμάτια της και τα κάψει, η GLaDOS καταστρέφεται και η Chell δραπετεύει από το κτίριο.
Αφού η Chell δραπετεύει, λιποθυμά και ένα ρομπότ την σέρνει πίσω στο κτίριο. Κατά τη διάρκεια των τίτλων, η GLaDOS τραγουδά ένα τραγούδι με τίτλο "Still Alive" γραμμένο από τον Jonathan Coulton, που λέει ότι παρόλο που η Chell τη σκότωσε, είναι ακόμα ζωντανή.
