Κατευθυνόμενη εξέλιξη
Η κατευθυνόμενη εξέλιξη (DE) είναι μια μέθοδος που χρησιμοποιείται για την παραγωγή ενζύμων για βιομηχανικούς ή ιατρικούς σκοπούς.
Η μέθοδος είναι η πρωτεϊνική μηχανική, η οποία μιμείται τη φυσική επιλογή.
Η βασική ιδέα είναι να υποβάλλεται ένα γονίδιο σε επαναλαμβανόμενους γύρους μετάλλαξης, ώστε να δημιουργηθεί μια βιβλιοθήκη παραλλαγών. Η επιλογή απομονώνει τα γονίδια με την επιθυμητή λειτουργία. Αποτελούν πρότυπο για τον επόμενο γύρο.
Αυτό μπορεί να γίνει in vivo (σε ζωντανά κύτταρα βακτηρίων ή ζύμης) ή in vitro (ελεύθερα σε διάλυμα ή μικροσταγονίδια).
Η δοκιμή περισσότερων μεταλλαγμένων αυξάνει τις πιθανότητες να βρεθεί ένα με τις επιθυμητές ιδιότητες.
Κατά τη διάρκεια της in vivo εξέλιξης, κάθε κύτταρο (συνήθως βακτήρια ή ζύμες) μετασχηματίζεται με ένα πλασμίδιο που περιέχει ένα διαφορετικό μέλος της βιβλιοθήκης παραλλαγών. Μόνο το γονίδιο ενδιαφέροντος διαφέρει μεταξύ των κυττάρων, ενώ όλα τα άλλα γονίδια παραμένουν ίδια.
Τα κύτταρα εκφράζουν την πρωτεΐνη είτε στο κυτταρόπλασμα είτε στην επιφάνειά τους, όπου μπορεί να ελεγχθεί η λειτουργία της. Αυτή η μορφή έχει το πλεονέκτημα της επιλογής ιδιοτήτων σε κυτταρικό περιβάλλον, πράγμα χρήσιμο όταν η εξελιγμένη πρωτεΐνη ή το RNA πρόκειται να χρησιμοποιηθεί σε ζωντανούς οργανισμούς.
Όταν γίνεται χωρίς κύτταρα, η DE χρησιμοποιεί in vitro μεταγραφή μετάφραση για την παραγωγή πρωτεϊνών ή RNA ελεύθερα σε διάλυμα ή μέσα σε τεχνητά μικροσταγονίδια. Αυτό έχει το πλεονέκτημα ότι επιτρέπει περισσότερες συνθήκες (π.χ. θερμοκρασία, διαλύτες). Μπορεί να εκφράσει πρωτεΐνες που θα ήταν τοξικές για τα κύτταρα. Επιπλέον, τα πειράματα in vitro εξέλιξης μπορούν να δημιουργήσουν πολύ μεγαλύτερες βιβλιοθήκες (έως και 10 15) επειδή το DNA της βιβλιοθήκης δεν χρειάζεται να εισαχθεί σε κύτταρα. Αυτό συχνά περιορίζει το τι μπορεί να γίνει.
Ένα παράδειγμα κατευθυνόμενης εξέλιξης σε σύγκριση με τη φυσική εξέλιξη. Ο εσωτερικός κύκλος δείχνει τα τρία στάδια του κύκλου της κατευθυνόμενης εξέλιξης με τη μιμούμενη φυσική διαδικασία σε παρένθεση. Ο εξωτερικός κύκλος δείχνει τα στάδια ενός τυπικού πειράματος. Τα κόκκινα σύμβολα υποδεικνύουν λειτουργικές παραλλαγές, τα ανοιχτόχρωμα σύμβολα υποδεικνύουν παραλλαγές με μειωμένη λειτουργία
Εξασφάλιση κληρονομικότητας
Όταν απομονώνονται λειτουργικές πρωτεΐνες, είναι απαραίτητο να απομονώνονται και τα γονίδιά τους, επομένως απαιτείται σύνδεση γονότυπου-φαινότυπου.
Αυτό μπορεί να είναι ομοιοπολικό, όπου το γονίδιο mRNA συνδέεται με την πρωτεΐνη στο τέλος της μετάφρασης με πουρομυκίνη.
Εναλλακτικά, η πρωτεΐνη και το γονίδιό της μπορούν να διατηρηθούν μαζί ή σε σταγονίδια γαλακτώματος. Οι αποµονωµένες αλληλουχίες γονιδίων πολλαπλασιάζονται στη συνέχεια µε PCR ή µε µετασχηµατισµένα βακτήρια ξενιστές. Είτε η μοναδική καλύτερη αλληλουχία, είτε μια ομάδα αλληλουχιών μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως πρότυπο για τον επόμενο γύρο μεταλλαξιγένεσης. Οι επαναλαμβανόμενοι κύκλοι διαφοροποίησης-επιλογής-ενίσχυσης καθιστούν τις παραλλαγές των ενζύμων προσαρμοσμένες στη διαδικασία επιλογής.
Μια εκφραζόμενη πρωτεΐνη μπορεί να συνδεθεί ομοιοπολικά με το γονίδιό της (όπως στο mrna), αριστερά, ή να τοποθετηθεί στο ίδιο διαμέρισμα με αυτό, δεξιά. Σε κάθε περίπτωση, το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη απομονώνεται
Βραβείο που απονέμεται
Η Αμερικανίδα μηχανικός Frances Arnold κέρδισε το Βραβείο Τεχνολογίας της Χιλιετίας για την πρωτοποριακή κατευθυνόμενη εξέλιξη.
Ερωτήσεις και απαντήσεις
Ε: Τι είναι η κατευθυνόμενη εξέλιξη;
A: Η κατευθυνόμενη εξέλιξη (DE) είναι μια μέθοδος που χρησιμοποιείται για την παραγωγή ενζύμων για βιομηχανικούς ή ιατρικούς σκοπούς. Είναι μια μορφή πρωτεϊνικής μηχανικής που μιμείται τη φυσική επιλογή.
Ε: Πώς λειτουργεί η κατευθυνόμενη εξέλιξη;
Α: Η κατευθυνόμενη εξέλιξη λειτουργεί με την υποβολή ενός γονιδίου σε επαναλαμβανόμενους γύρους μετάλλαξης, δημιουργώντας μια βιβλιοθήκη παραλλαγών. Στη συνέχεια, η επιλογή απομονώνει γονίδια με την επιθυμητή λειτουργία, τα οποία στη συνέχεια χρησιμοποιούνται ως πρότυπα για τον επόμενο γύρο.
Ερ: Πού μπορεί να γίνει κατευθυνόμενη εξέλιξη;
Α: Η κατευθυνόμενη εξέλιξη μπορεί να γίνει in vivo (σε ζωντανά κύτταρα βακτηρίων ή ζύμης) ή in vitro (ελεύθερα σε διάλυμα ή μικροσταγονίδια).
Ερ: Ποια είναι τα πλεονεκτήματα της κατευθυνόμενης εξέλιξης in vivo;
Α: Η κατευθυνόμενη εξέλιξη in vivo έχει το πλεονέκτημα της επιλογής ιδιοτήτων σε κυτταρικό περιβάλλον, το οποίο είναι χρήσιμο όταν η εξελιγμένη πρωτεΐνη ή το RNA πρόκειται να χρησιμοποιηθεί σε ζωντανούς οργανισμούς.
Ε: Ποια είναι τα πλεονεκτήματα της κατευθυνόμενης εξέλιξης in vitro;
Α: Η πραγματοποίηση κατευθυνόμενης εξέλιξης in vitro έχει το πλεονέκτημα ότι επιτρέπει περισσότερες συνθήκες (π.χ. θερμοκρασία, διαλύτες) και μπορεί να εκφράσει πρωτεΐνες που θα ήταν τοξικές για τα κύτταρα. Επιπλέον, μπορεί να δημιουργήσει πολύ μεγαλύτερες βιβλιοθήκες επειδή το DNA δεν χρειάζεται να εισαχθεί σε κύτταρα.
Ερ: Τι περιορίζει το τι μπορεί να γίνει κατά τη διάρκεια ενός πειράματος in vitro;
Α: Το όριο μεγέθους για το τι μπορεί να γίνει κατά τη διάρκεια ενός in vitro πειράματος καθορίζεται συχνά από το πόσο DNA πρέπει να εισαχθεί σε κύτταρα.
